（来源：DrugAI）

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研究人员致力于从头设计能够结合小分子的蛋白质，这一方向有望实现针对任意小分子的按需传感器构建。在本研究中，研究人员结合深度学习与基于物理的建模方法，构建了一类具有多样化口袋结构且可设计性的蛋白家族，并利用该家族针对六种不同小分子进行结合蛋白设计。生物物理实验表明，这些设计蛋白能够以纳摩尔至低微摩尔水平的亲和力结合目标分子，并达到原子级别的设计精度。此外，研究人员基于一种皮质醇结合蛋白构建了化学诱导二聚化系统，从而实现了皮质醇生物传感器的设计。该研究展示了NTF2折叠以及深度学习驱动蛋白设计在传感器开发中的潜力，为未来在分析、环境和生物医学领域设计小分子结合蛋白与传感系统提供了新路径。

高亲和性和高特异性的蛋白-小分子结合设计在生物技术中具有重要意义，例如可用于构建能够响应配体结合发生构象变化的生物传感器或分子开关。现有方法主要依赖天然蛋白的发现与工程改造，而基于物理模型的设计策略通常需要借助天然蛋白骨架。尽管已有研究利用四螺旋束或桶状结构进行从头设计，并发展了骨架多样化方法，但能够系统性地扩展结构类型并将其转化为传感器的通用策略仍然有限。

研究人员提出，通过结合深度学习驱动的蛋白结构生成与序列设计，可以充分利用NTF2样折叠结构构建具有多样口袋的蛋白集合，从而支持多种小分子的结合设计。该策略基于两个关键原则：一是蛋白结构需具备稳定且可调节的结合口袋，二是骨架需同时具备紧凑性和可扩展性，以支持不同结合模式的生成。此外，为实现后续的化学诱导二聚化传感机制，设计还要求配体在结合后部分暴露，以便调控蛋白-蛋白相互作用。

方法

研究人员首先利用深度学习方法生成并多样化NTF2样蛋白骨架，随后结合ProteinMPNN与LigandMPNN进行序列设计，并通过AlphaFold筛选结构稳定性。针对不同小分子，采用RIFdock进行配体对接，并通过两种策略构建蛋白-配体界面：一种利用预构建氢键网络引导极性相互作用，另一种直接基于深度学习模型优化蛋白-配体相互作用。最终通过多项能量与结构指标筛选候选设计，并进入实验验证流程。

结果

小分子结合蛋白的计算设计

研究人员构建了超过一万个具有不同口袋几何结构的NTF2样蛋白骨架，并将六种结构和化学性质差异显著的小分子嵌入这些结构中进行设计。这些分子包括激素、抗凝药物和抗癌分子等。通过引入氢键网络或使用深度学习模型进行序列设计，成功在蛋白内部构建稳定且预组织化的极性结合界面。

小分子结合蛋白的实验表征

通过酵母展示和流式分选，研究人员在所有六种目标分子中均获得了可检测的结合信号，并筛选出多个高质量候选。结构预测结果显示这些蛋白具有较高折叠可信度和较低结构偏差，同时在结合界面上表现出良好的形状互补性和多种相互作用类型。

进一步的纯化与生物物理测定表明，多数蛋白能够稳定表达，其中一部分表现出单体状态并具有较高结合亲和力。最终测得的结合常数分布在低微摩尔至高纳摩尔范围，表明设计策略能够实现较高精度的结合调控。

研究还发现，结构上更接近天然NTF2家族的骨架更容易产生有效结合蛋白，提示结构空间探索仍存在一定偏向性。

结构解析验证设计精度

研究人员解析了两个蛋白-配体复合物的晶体结构，结果显示其与设计模型高度一致，主链偏差低至亚埃级别。关键氢键和疏水相互作用均被准确复现，验证了设计方法在原子尺度上的可靠性。

结合特异性分析

通过交叉结合实验，研究人员发现多数设计蛋白优先结合其目标分子，但在结构相似的小分子之间仍存在一定交叉反应。例如某些类固醇分子之间的区分能力有限，而疏水性较强的分子也更容易产生非特异性结合。这表明在未来需要进一步优化特异性设计策略。

皮质醇诱导二聚化与传感器构建

研究人员对皮质醇结合蛋白进行优化，使其亲和力提升至纳摩尔水平。基于该结合模式，设计了一个依赖配体的蛋白异源二聚化系统，其中配体在结合后部分暴露，作为桥接界面促进蛋白复合物形成。

进一步将该系统与NanoBiT发光体系结合，构建了一个皮质醇传感器，其响应范围与蛋白结合亲和力高度一致，证明了该策略在生物传感中的可行性。同时，实验表明该传感器对部分结构相似分子也有响应，提示仍需进一步优化选择性。

讨论

研究人员通过整合深度学习结构生成、序列设计与结构预测方法，构建了一个能够支持小分子结合设计的蛋白骨架集合，并成功实现了多个小分子的结合蛋白设计及其传感功能扩展。研究结果表明，基于特定折叠结构的大规模结构与序列空间探索，可以有效用于功能蛋白设计。

当前方法在某些目标分子上表现出较高成功率，尤其是与天然NTF2配体相似的分子，但在更广泛化学空间中的泛化能力仍有提升空间。未来的发展方向包括：针对特定小分子定制结构生成模型、提高蛋白-配体相互作用预测精度，以及开发更高特异性的设计策略。整体而言，该研究为从头设计小分子结合蛋白与传感器提供了重要框架，并展示了其在生物医学与分析领域的广阔应用前景。

整理 | DrugOne团队