转自：优宁维抗体专家

凝胶过滤层析是蛋白纯化常用的方法之一，拿到了新柱子，大家是不是就准备跃跃欲试啦！先别着急，来看看下面这些使用小TIPS。

1

第一次使用分子筛，有什么注意点？

（1）拿到分子筛之后，需要认真检查分子筛外观是否完整，各部位配件是否完好，填料是否充满整个柱管。

（2）在连接柱子之前，应确保上样缓冲液和仪器管道中没有气泡。移除连接在柱子上的储液装置。检查上端的柱头是否锁死（检查黑色的locking ring是否压至最底端）。

黑色箭头所示的配件是locking ring（Increase分子筛）

（3）未拆开的新柱子里填装有20%乙醇，在使用前应先用去离子水冲掉柱子里乙醇后继续使用。分子筛超压会严重损坏柱床，因此在连接仪器之前需设置报警压，然后以液滴对液滴的方式连接柱子。

2

层析柱堵了或者超压了怎么办？

分子筛使用3-5次后，或者层析柱顶端颜色改变，发生堵塞，超压，分辨率下降等情况时，建议进行定期清洗和再生。

Superdex和Superose系列（反向清洗）

（1）用1柱体积（CV）0.5 M氢氧化钠或0.5 M醋酸清洗层析柱；

（2）立即用1 CV去离子水和至少2 CV缓冲液冲洗层析柱；

Hiprep Sephacryl系列（正向清洗）

（1）用1柱体积（CV）0.2 M氢氧化钠清洗层析柱；

（2）立即用1 CV去离子水和至少2 CV缓冲液冲洗层析柱；

如果常规清洗仍无法达到理想的效果，可以根据残留物的不同选择其它的清洗方式：例如：0.5M 醋酸溶液，0.5M精氨酸，1M NaOH，8M尿素或者6M 盐酸胍（针对蛋白沉淀），30%异丙醇（对于脂类或者疏水物质），再者还可以考虑使用胃蛋白酶（1mg/ml溶于0.1M醋酸、0.5M NaCl中）消化，再使用NaOH清洗。然后再用2个柱体积的水和2个柱体积的缓冲液平衡。（Sephacryl最高使用0.5M NaOH清洗）

层析柱堵塞的原因也可能是滤膜堵塞，此时需要考虑更换滤膜。

3

系统显示压力过高，此时应该如何处理？

系统显示压力过高，此时先不着急处理柱子。应该先判断是层析系统超压还是层析柱超压。层析系统在不接层析柱的情况下，设置系统流速0.1ml/min，system pressure的压力应为0.2 Mpa左右（反压阀在线情况下）。

（1）如果系统空跑的压力超过0.2 Mpa，则需进行系统清洗；

（2）如果系统压力正常，需要对层析柱进行CIP清洗。

4

分子筛上端出现空隙，还能继续使用嘛？

分子筛使用一段时间之后，可能因为超压等原因，发现分子筛上端出现了一段空隙。这个时候如果继续使用分子筛，柱效会有影响。

此时正确的处理方法应该是：

（1）取下层析柱静置，看柱床是否能恢复至初始液面，如果恢复，直接反向清洗层析柱；

（2）如果柱床胶面没有恢复，将柱头向下拧至填料顶端，并反向冲洗层析柱。

分子筛上端出现空隙

5

分子筛出现气泡，应该怎么处理？

在层析柱的使用过程中，可能因为缓冲液或者样品没有脱气等原因，层析柱中可以观察到明显气泡，或者层析图谱中紫外或压力曲线出现锯齿状波动，此时应进行排气泡操作。

（1）选择脱气后的缓冲液（反压阀在线）；

（2）以0.04ml/min的流速反向冲洗3-4个柱体积；

层析图谱中压力或UV曲线出现锯齿状波动

6

分子筛如何保存？

一、分子筛短期保存

1、分子筛在使用后用缓冲液清洗1-2个柱体积；

2、取下柱子后，连接储液装置和堵头，以防止柱子干裂；

二、分子筛长期保存

如果超过2天不使用层析柱，建议使用1-2倍柱体积的水冲洗柱子后再使用1-2倍柱体积的20%乙醇冲洗柱子保存。（Hiload Superdex 30pg与Hiload Superdex 75pg建议在20%乙醇中加入0.2M NaAc，以保持pH的稳定）。

1、分子筛在使用后用缓冲液清洗1-2个柱体积；

2、使用1-2柱体积去离子水冲洗柱子；

3、使用1-2柱体积20%乙醇冲洗柱子；

4、取下柱子后，连接储液装置和堵头，以防止柱子干裂；

应注意：层析柱需在4-40℃条件下储存，不可冷冻保存和运输。

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（转自：优宁维抗体专家）